מה יכולה להיות הבעיה אם הלהקות לא מופיעות ב- Western Blot?

מה יכולה להיות הבעיה אם הלהקות לא מופיעות ב- Western Blot?
Anonim

תשובה:

רב…

הסבר:

ישנן סיבות רבות מדוע להקות לא יכול להופיע על כתם המערבי. האם צירופי הדגימה והנוגדן עבדו בעבר?

להלן רק כמה שאני יכול לחשוב כרגע כי עלול לגרום להקות לא להופיע:

  1. האם העברת חלבון מן הג'ל? נסה מכתים את הממברנה עם משהו כמו ponceau S או amido שחור כדי לראות אם הלהקות נוכחים. לפעמים, אתה יכול לראות את להקות חלבון על הממברנה על ידי הרטבה אותו מחזיק אותו בזווית לאור.

  2. האם הנוגדן העיקרי עובד? זהו אחד קשה לבדוק את הדרך היחידה שאתה יכול היא על ידי כולל שליטה חיובית שבו אתה יודע שיש לך את החלבון של עניין הנוכחי. אם יש לך כמה חלבון של עניין אתה יכול לנסות לזהות את זה על הממברנה המערבי סופג (כלומר אתה לא מפעיל את הג'ל) ולראות אם אתה מקבל תוצאה אם אתה מעבד את הממברנה כאילו זה כתם המערבי.

  3. האם הנוגדן משני מזהה את הנוגדן העיקרי? שוב, קשה לבדוק. על המבחן היחיד שאתה יכול לעשות הוא מבחן נקודה כאמור לעיל 2.

  4. האם "מערכת הזיהוי" עובדת? בהתאם לשיטת האיתור אתה משתמש אתה יכול לנסות spiking בחלק נוגדנים משני כדי לראות אם פתרון איתור, וגם מפעיל את הסוכן / אנזים על הנוגדנים המשניים, הוא עובד. כלומר, אתה יכול להפעיל את התגובה רק עם הנוגדן משני?

לבסוף, זה יכול להיות פשוט כמו אחד הפתרונות המשמשים במהלך בדיקה של העלילה להיות מורכב באופן שגוי. לדוגמה, אם ריכוז המלח טעה במאגר אז זה עלול לגרום נוגדנים להשתחרר מן הכתם. זה היה קורה גם אם ה- pH של המאגרים היו שגויים.

הסיבה ה"מוזרה ביותר "לכתם מערבי שלא עבדתי באופן אישי היתה כאשר שינינו את ספק אבקת החלב שהשתמשנו בו כדי לחסום את הממברנה. אבקת מהספק החדש הכיל phosphatase phosphotyrosine אשר הסיר את כל קבוצות פוספט שאנחנו מנסים לזהות עם נוגדן אנטי phosphotyrosine שלנו.